Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Trasformazione batterica

Alcune specie batteriche possono acquisire DNA estraneo dall’ambiente e vengono dette per questo motivo “naturalmente competenti”. La competenza, ossia la capacità di acquisire DNA dall’esterno, dipende dalla secrezione all’esterno della cellula di una molecola di natura polipeptidica, detta fattore di competenza, che induce nella cellula batterica la sintesi di specifici recettori di membrana. Questi recettori legano il DNA e lo trasportano nel citoplasma dove, se esistono regioni di omologia tra il DNA estraneo e quello cellulare, avviene un evento di ricombinazione che determina l’integrazione del DNA estraneo sul cromosoma e la sua eventuale espressione nella cellula ospite. Tutti i batteri tuttavia hanno la capacità di assumere DNA “nudo” dall’ambiente, ma è necessario indurre in laboratorio uno stato di competenza artificiale. Ciò è reso possibile da una temporanea permeabilità della membrana cellulare al DNA, ottenuta con metodi chimici (esponendo le cellule ad elevate concentrazioni di ioni metallici come ad es. ioni Ca⁺⁺) o fisici (esponendo le cellule ad impulsi di corrente ad alto voltaggio per tempi molto brevi come nell’elettroporazione). Tali metodi di trasformazione artificiale sono particolarmente efficaci con molecole di DNA circolare e sono comunemente utilizzati per introdurre molecole di DNA ricombinante in cellule batteriche. Infatti, quando si vuole far esprimere un frammento di DNA di interesse esso viene inserito in un vettore di DNA in grado di replicarsi selettivamente in un altro organismo più semplice come il batterio Escherichia coli, permettendone così l’amplificazione e l’espressione. La trasformazione di E. coli è resa possibile dall’effetto combinato del CaCl₂ e del calore che rendono la membrana temporaneamente “permeabile” all’ingresso di DNA plasmidico (pUC19), con meccanismi molecolari che rimangono ancora oggi parzialmente sconosciuti.

Protocollo sperimentale

ü Effettuare una lettura spettrofotometrica di una coltura di Escherichia coli (TOP10) in crescita ogni 30 minuti, finché la coltura non arriva in fase medio-logaritmica.

ü Prelevanre 1 ml dalla coltura e leggere il valore di assorbanza a 600nm, contro un “bianco” contenente solo LB.

ü Quando la coltura in crescita raggiunge una OD₆₀₀ di 0.4, prelevare sterilmente 1,5 ml dalla coltura e mettere in ghiaccio per 10 minuti.

ü Centrifugare per 5 minuti a 4000rpm a 4°C.

ü Eliminare il sopranatante sterilmente e mettere in ghiaccio il pellet cellulare.

ü Risospendere il pellet in 1,5 ml di una soluzione 0.1M di CaCl₂ fredda.

ü Lasciare in ghiaccio per 10 minuti.

ü Centrifugare nuovamente per 5 minuti a 4000rpm a 4°C.

ü Eliminare il sopranatante sterilmente e mettere in ghiaccio il pellet cellulare.

ü Risospendere il pellet in 200µl della soluzione 0.1M di CaCl₂ fredda e mantenere in ghiaccio.

ü Marcare due provette sterili nel seguente modo: TOP10 + pUC19 (trasformazione); TOP10 (controllo).

ü Prelevare 100µl di cellule competenti e introdurli nelle due provette.

ü Aggiungere 5µl di una soluzione 10 pg/µl del plasmide pUC19 nella provetta TOP10 + pUC19 e mescolare con delicatezza.

ü Lasciare entrambe le provette in ghiaccio per 15 minuti.

ü Sottoporre le cellule ad uno shock termico, ponendo le provette in un bagnetto a 42°C e lasciarle per 90 secondi [Fig. 1].

ü Rimettere immediatamente le provette in ghiaccio per un 1 minuto.

ü Aggiungere 900µl di terreno LB in ciascuna provetta.

ü Incubare le provette per 30 minuti in un agitatore a 37°C.

ü Preparare una piastra di terreno solido LB agar, versando circa 25ml di terreno LB agar, e lasciare solidificare.

ü Preparare 3 piastre di terreno solido LB agar + ampicillina, aggiungendo 25µl di soluzione di ampicillina (50mg/ml) per ogni 25 ml di terreno prima di versarlo nelle piastre Petri.

ü Spatolare su piastre di LB + ampicillina (50µg/ml) e di LB le quantità di cellule riportate in tabella [Fig. 2]:

	TOP10 + pUC19	TOP10
LB + ampicillina	10 µl - 100 µl	10 µl
LB		10 µl

ü Incubare le piastre a 37°C per 12-15 ore.

ü Osservare le piastre ottenute e prelevare le colonie di E. coli trasformate [Fig. 3].

Fig. 1: cellule sottoposte a shock termico durante la trasformazione.

Fig. 2: spatolamento su piastra delle cellule trasformate.

Fig. 3: schema del risultato atteso dalla trasformazione.