Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Tecnica dell’antibiogramma

La crescita dei microrganismi può essere controllata mediante l’uso di agenti antimicrobici, composti chimici naturali o di sintesi che uccidono i microrganismi o ne inibiscono la crescita; tuttavia la distinzione tra la capacità di un composto di determinare la morte o l’inibizione della crescita di microrganismi è spesso arbitraria, in quanto lo stesso composto può essere letale ad alte concentrazioni, mentre a basse concentrazioni può limitarsi ad avere effetto inibente. Agenti antimicrobici dotati di tossicità selettiva contro i batteri sono particolarmente utili come chemioterapici per il trattamento delle malattie infettive, in quanto possono essere usati per uccidere i microrganismi patogeni senza danneggiare l’ospite. Nell’ambito degli agenti antimicrobici, si distinguono: i disinfettanti, agenti che uccidono gli organismi e che non possono essere utilizzati sui tessuti viventi, bensì su tavoli, pavimenti, utensili; gli agenti chemioterapici, di origine sintetica utili nel trattamento di malattie batteriche o virali; gli antibiotici, prodotti dai microrganismi, che uccidono o inibiscono la crescita di altri microrganismi. L’attività antimicrobica si misura determinando la più piccola concentrazione del composto in esame necessaria per inibire la crescita di un dato organismo; tale concentrazione viene chiamata minima concentrazione inibente (MIC). Una procedura utilizzata per valutare la sensibilità agli antibiotici di un ceppo batterico è il metodo per diffusione in terreno agarizzato (tecnica dell’antibiogramma o di Kirby-Bauer). La piastra di terreno agarizzato viene inoculata con il microrganismo in modo che si formi uno strato superficiale sottile. Dischetti di carta da filtro, intrisi di antibiotici, vengono depositati poi sulla superficie del terreno agarizzato. In questo modo, durante l’incubazione, il composto diffonde creando un gradiente di concentrazione: quanto più ci si allontana dal dischetto tanto minore sarà la sua concentrazione, fino al punto in cui si raggiungerà la MIC. Al di là di questo punto si avrà crescita confluente, mentre nella zona più vicina al dischetto non si osserverà crescita (alone di inibizione). Il diametro dell’alone di inibizione è direttamente proporzionale al grado di suscettibilità del microrganismo in coltura e fornisce quindi l’indicazione della suscettibilità o della resistenza verso l’antibiotico specifico utilizzato. Il pattern di suscettibilità verso i diversi antibiotici è definito antibiogramma. L’importanza dell’antibiogramma si basa sul principio che la sensibilità in vitro prefigura l'efficacia in vivo della terapia antibiotica; il test di sensibilità agli antibiotici serve non solo per orientare la terapia antibiotica, ma anche per monitorare l’evoluzione della resistenza batterica e dare quindi le basi del trattamento empirico delle infezioni batteriche. Molti test di laboratorio non misurano la MIC ma una stima della MIC semiquantitativa. Questa stima meno accurata della MIC è data da 2 concentrazioni di antibiotico note come breakpoints che determinano le 3 seguenti categorie: S (Sensibile, significa che l’infezione può essere trattata con quell’antibiotico al dosaggio usuale); I (Intermedia, l’infezione può essere trattata con quell’antibiotico a un dosaggio leggermente più alto di quello usuale); R (Resistente, ceppi resistenti non inibiti dalle concentrazioni sistemiche dell’antibiotico ai dosaggi normali e anche a quelli più alti). Spesso nell’antibiogramma si testano antibiotici che non hanno alcuna importanza terapeutica come l’oxacillina. L’oxacillina è un marker di resistenza nel caso degli stafilococchi. La resistenza alla oxacillina prefigura una resistenza più estesa ad alcune classi di antibiotici quali penicilline, chinoloni, aminoglicosidi e i macrolidi. Per l’esercitazione si utilizzano Escherichia coli e Staphylococcus aureus, potenzialmente patogeno come già discusso, per cui l’apertura della coltura liquida e lo spatolamento su piastra vanno eseguiti sotto una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale.

Protocollo sperimentale

ü Preparare 4 piastre di terreno solido Muller-Hinton agar, sciogliendo in 100 ml di acqua distillata l’opportuna quantità di polvere e sterilizzando in autoclave.

ü Lasciar raffreddare le piastre di terreno agarizzato.

ü Prelevare 0.2 ml da una brodocoltura di Staphylococcus aureus e distribuirli sulla superficie di ciascuna piastra con una spatola monouso.

ü Chiudere le piastre e lasciare asciugare per qualche minuto.

ü Prelevare con pinzette sterili i dischetti contenenti gli antibiotici per stafilococchi e streptococchi [Fig. 1].

ü Appoggiare i dischetti sulla piastra a una distanza di almeno 15 mm dal bordo della piastra, evitando di strisciarli sul terreno [Fig. 2].

ü Utilizzando le pinzette, far aderire perfettamente i dischetti al terreno.

ü Ripetere tutta l’operazione con la brodocoltura di Escherichia coli, impiegando i dischetti contenenti gli antibiotici per enterobatteri Gram- urinari.

ü Incubare a 37°C per 18-24 ore.

ü Osservare gli aloni di inibizione originatisi sulle piastre incubate con E. coli e S. aureus [Fig. 3].

ü Misurare con un righello l’alone di inibizione per ciascun antibiotico, completando la tabella sottostante e individuando verso quali antibiotici gli organismi testati risultano suscettibili.

Antimicrobial agent	R = mm or less	I = mm	S = mm or more	Alone misurato
erythromycin	13	14-22	23
amoxicillin/clavulanic acid - Staphylococcus	19	-	20
sulfamethoxazole + trimethoprim (co-trimoxazole)	10	11-15	16
ciprofloxacin	15	16-20	21
imipenem	13	14-15	16
mezlocillin	12	13-15	16
cefoperazone	15	16-20	21
penicillin	28	-	29

Antimicrobial agent	R = mm or less	I = mm	S = mm or more	Alone misurato
ceftazidime	14	15-17	18
sulfamethoxazole + trimethoprim (co-trimoxazole)	10	11-15	16
gentamicin	12	13-14	15
norfloxacin	12	13-16	17
netilmicin	12	13-16	17
nitrofurantoin	14	15-16	17
cefoperazone	15	16-20	21
imipenem	13	14-15	16

Fig. 1: dischetti imbevuti di antibiotici da posizionare sulle colture batteriche.

Fig. 2: dischetti di antibiotico posizionati sulle piastre contenenti le colture batteriche.

Fig. 3: aloni di inibizione sviluppati sulle piastre dopo l’incubazione a 37°C.