Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Identificazione con Api

L’analisi delle caratteristiche biochimiche e fisiologiche rappresenta un aspetto molto importante nello studio e nella identificazione dei microrganismi. I test biochimici che permettono di valutare le capacità fermentative, o metaboliche in generale, e la presenza di attività enzimatiche specifiche hanno come limitazione principale il tempo occorrente per apprezzare le modificazioni prodotte dai microrganismi. La semplicità e la riproducibilità, se accoppiate alla rapidità, consentono invece un ampio uso di questi test; sono così nati una serie di sistemi miniaturizzati, forniti da diverse case produttrici, che hanno il vantaggio di evidenziare differenti attività biochimiche in un’unica soluzione, dal momento che possono essere inoculati tutti in una volta e letti in un tempo breve (circa 24h). Le precedenti fasi di identificazione del microrganismo quali isolamento in terreni selettivi, valutazione delle caratteristiche morfologiche e tintoriali e test preliminari di orientamento, permettono di individuare il tipo di kit più appropriato per l’identificazione finale. La galleria Api20E ad esempio è indicata nell’identificazione degli Enterobatteri; è composta da 20 microprovette contenenti substrati disidratati che vengono inoculate con una sospensione batterica, ricostituendo così i terreni. Le reazioni prodotte durante il periodo di incubazione si traducono in viraggi colorati spontanei o rivelati in seguito all’aggiunta di reattivi. La lettura di queste reazioni (positiva/negativa) viene registrata su una apposita tabella che permette di ottenere un profilo numerico; tale profilo numerico permette l’identificazione della specie attraverso il confronto con un software di identificazione.

I test biochimici presenti nell’API20E sono:

• [GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA] Reazioni di fermentazione di diversi zuccheri: la positività dei test è indicata dal viraggio dell’indicatore da blu a giallo causato dalla produzione di acidi nel mezzo.

• [CIT] Utilizzazione del citrato come unica fonte di C: la positività dei test è indicata dal viraggio dell’indicatore blu di bromofenolo causato dall’alcalinizzazione del mezzo.

• [VP] Test di Voges-Proskauer per evidenziare la produzione di acetoina durante la fermentazione: la positività del test è indicata dallo sviluppo di una colorazione rossastra, in seguito alla reazione tra acetoina e reagenti specifici, aggiunti dopo l’incubazione.

• [ONPG] Presenza dell’enzima β-galattosidasi: la positività del test è indicata dalla colorazione gialla conferita al terreno dall’ortonitrofenolo, derivato dalla scissione dell’ortonitrofenil-galattoside operata dall’enzima.

• [ADH] Presenza dell’enzima arginina deidrolasi: la positività del test è indicata dal viraggio dell’indicatore a rosso-arancio, causato dall’alcalinizzazione del terreno in seguito alla trasformazione dell’arginina in citrullina, un’amina alcalina, operata dall’enzima.

• [LDC, ODC] Presenza degli enzimi lisina e ornitina decarbossilasi: la positività del test è indicata dal viraggio dell’indicatore a rosso-arancio, causato dall’alcalinizzazione del terreno in seguito formazione di amine alcaline causata dagli enzimi.

• [URE] Presenza dell’enzima idrolitico ureasi: la positività del test è indicata dal viraggio dell’indicatore a rosso-arancio, causato dall’alcalinizzazione del terreno in seguito alla idrolisi dell’urea in NH₃ e CO₂, operata dall’enzima.

• [GEL] Presenza dell’enzima proteolitico gelatinasi: la positività del test è indicata dal fatto che la gelatina se idrolizzata dalle proteasi diventa liquida, permettendo la diffusione di un pigmento nero che colora la provetta.

• [TDA] Presenza dell’enzima triptofano deaminasi: la positività del test è indicata dalla colorazione rossastra che si origina dalla reazione operata dall’enzima in presenza di triptofano e cloruro di ferro, che viene successivamente aggiunto dopo l’incubazione.

• [IND] Capacità di produrre indolo dalla degradazione del triptofano: la positività del test è indicata dallo sviluppo della colorazione rossastra, in seguito alla reazione dell’indolo con il reattivo di Kovacs che viene successivamente aggiunto dopo l’incubazione.

• [H₂S] Produzione di idrogeno solforato: la positività del test è indicata dal fatto che l’H₂S prodotto durante il metabolismo reagisce con il citrato ferrico formando solfuro ferrico, che forma una precipitato di colore nero.

Per l’esercitazione vengono utilizzati quattro diversi batteri che permettono di osservare reazioni positive/negative in tutte la provette. Tre di loro sono enterobatteri (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Klebsiella pneumoniae) e possono essere quindi identificati con la Api20E, uno invece, Bacillus subtilis, darà luogo ad un codice non valido per questo sistema identificativo. I nomi dei microrganismi possono essere mantenuti eventualmente segreti, se si vuole simulare l’identificazione. A causa della potenziale patogenicità di alcuni batteri utilizzati, come già discusso, l’apertura delle piastre e la preparazione delle gallerie vanno eseguite sotto una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale.

Protocollo sperimentale

ü Preparare 4 vaschette di incubazione distribuendo in ciascuna circa 5 ml di acqua distillata negli alveoli per creare un ambiente umido.

ü Estrarre le gallerie dalla confezione e metterle nelle vaschette di incubazione [Fig. 1].

ü Risospendere nell’apposito mezzo una colonia prelevata da terreno agarizzato.

ü Utilizzare i seguenti microrganismi: 1) Escherichia coli; 2) Pseudomonas aeruginosa; 3) Bacillus subtilis; 4) Klebsiella pneumoniae.

ü Riempire provette (parte chiusa) e cupole (parte aperta) dei test CIT, VP, e GEL con la sospensione batterica.

ü Riempire solo le provette e non le cupole degli altri test con la sospensione batterica.

ü Creare un’anaerobiosi nei test ADH, LDC, ODC, URE, H₂S, ricoprendo le cupole con olio di paraffina [Fig. 2].

ü Richiudere le vaschette di incubazione e incubare a 37°C per 12-15 ore.

ü Osservare le reazioni avvenute nelle provette GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA.

ü Annotare per ciascuna di esse l’esito positivo [giallo] o negativo [blu/verde] della reazione [Fig. 3].

ü Osservare la reazione avvenuta nella provetta ONPG. Annotare l’esito positivo [giallo] o negativo [bianco] della reazione.

ü Osservare la reazione avvenuta nella provetta ADH. Annotare l’esito positivo [rosso/arancio] o negativo [giallo] della reazione.

ü Osservare le reazioni avvenute nelle provette LDC, ODC. Annotare l’esito positivo [rosso/arancio] o negativo [giallo] delle reazioni.

ü Osservare la reazione avvenuta nella provetta CIT. Annotare l’esito positivo [blu] o negativo [verde] della reazione.

ü Osservare la reazione avvenuta nella provetta H₂S. Annotare l’esito positivo [nero] o negativo [bianco] della reazione.

ü Osservare la reazione avvenuta nella provetta URE. Annotare l’esito positivo [rosso/arancio] o negativo [giallo] della reazione.

ü Osservare la reazione avvenuta nella provetta GEL. Annotare l’esito positivo [nero] o negativo [bianco] della reazione.

ü Completare il test nella provetta TDA, aggiungendo una goccia di reattivo (percloruro di ferro + acqua).

ü Annotare l’esito positivo [marrone-rossastro] o negativo [giallo] della reazione.

ü Completare il test nella provetta VP, aggiungendo una goccia dei reattivi VP1 (idrossido di potassio + acqua) e VP2 (α-naftolo + etanolo).

ü Attendere almeno 10 minuti e annotare l’esito positivo [rosso intenso] o negativo [bianco/rosa] della reazione.

ü Completare il test nella provetta IND, aggiungendo una goccia di reattivo di James.

ü Annotare l’esito positivo [rosso] o negativo [bianco] della reazione.

ü Confrontare le diverse gallerie preparate verificando le differenze colorimetriche dei diversi test.

ü E. coli (1) risulta positivo per LDC, IND, GLU, MAN, SOR, RHA, MEL, ARA.

ü P. aeruginosa (2) risulta positivo per ADH, CIT, TDA, GEL, GLU, ARA.

ü B. subtilis (3) risulta positivo per ONPG, VP, GEL.

ü K. pneumoniae (4) risulta positivo per LDC, CIT, URE, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA.

ü Eventualmente dai risultati annotati è possibile ricavare per ciascun campione il profilo numerico a 7 cifre e confrontarlo con la lista dei profili disponibile [Fig. 4].

Fig. 1: Galleria Api20E con terreni liofilizzati pronta per gli inoculi.

Fig. 2: Galleria Api20E come appare dopo l’aggiunta della sospensione batterica nelle provette.

Fig. 3: Gallerie Api20E inoculate con i diversi microrganismi, dopo incubazione a 37°C.

Fig. 4: Scheda riassuntiva per ottenere il profilo numerico a 7 cifre per l’identificazione dei batteri.