Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Terreno selettivo EMB

Con il termine di terreni selettivi si indicano quei terreni di coltura che, per la loro particolare composizione, favoriscono la crescita di particolari microrganismi o ne inibiscono quella di potenziali competitori; la presenza ad esempio nel mezzo di sali biliari o coloranti basici inibisce la crescita dei batteri Gram-positivi, favorendo di conseguenza quella dei Gram-negativi, verso i quali non hanno alcun effetto inibitorio. I terreni selettivi vengono usati per isolare e identificare i batteri. Il terreno EMB agar (Eosin methylene blue) viene impiegato per evidenziare la presenza di Escherichia coli, e di altri enterobatteri correlati, in acqua o in altri tipi di campione. Contiene eosina e blu di metilene che inibiscono parzialmente la crescita dei batteri Gram-positivi e differenziano all’interno degli enterobatteri tra quelli in grado di fermentare il lattosio (es. E. coli) e quelli che non sono in grado di farlo (es. Shigella, Salmonella, Pseudomonas). La fermentazione del lattosio fa infatti precipitare i coloranti con la formazione di caratteristiche colonie blu-nere. Per l’esercitazione vengono utilizzati tre diversi enterobatteri quali Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae e Shigella flexneri. A causa della potenziale patogenicità di alcuni batteri utilizzati, come già discusso, l’apertura delle colture liquide e l’isolamento su piastra vanno eseguiti sotto una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale.

Protocollo sperimentale

ü Sciogliere in una bottiglia con 75 ml di acqua distillata l’opportuna quantità di polvere di terreno EMB agar.

ü Sterilizzare in autoclave, versare il terreno di coltura in tre piastre Petri e lasciarlo solidificare nelle piastre.

ü Prelevare 20µl di coltura batterica liquida ed effettuare un isolamento su ciascuna piastra.

ü Utilizzare i seguenti microrganismi: 1) Escherichia coli; 2) Klebsiella pneumoniae; 3) Shigella flexneri.

ü Incubare le piastre a 37°C per una notte.

ü Osservare le piastre di E. coli dopo l’incubazione: colonie caratteristiche dal colore verde brillante, per la precipitazione dei coloranti [Fig. 1 e 4].

ü Osservare le piastre di K. Pneumoniae dopo l’incubazione: colonie caratteristiche dal colore rosso, per la precipitazione dei coloranti [Fig. 2 e 4].

ü Osservare le piastre di S. flexneri dopo l’incubazione: cresce senza fermentare il lattosio presente nel mezzo, per cui le colonie appaiono semplicemente opache [Fig. 3 e 4].

Fig. 1: colonie di E. coli cresciute su terreno selettivo EMB.

Fig. 2: colonie di K. pneumoniae cresciute su terreno selettivo EMB.

Fig. 3: colonie di S. flexneri cresciute su terreno selettivo EMB.

Fig. 4: colonie di E. coli, K. pneumoniae e S. flexneri a confronto, cresciute su terreno selettivo EMB.