Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Test dell’ossidasi

 

L’enzima citocromo ossidasi svolge un importante ruolo durante il trasporto di elettroni della catena respiratoria. Soltanto alcuni batteri possiedono tale enzima respiratorio e la sua presenza può essere un carattere identificativo e può essere messa in evidenza mediante un semplice test in cui un substrato artificiale, l’N,N-dimetil-p-fenilendiamina ossalato, cede elettroni alla citocromo ossidasi e ossidandosi forma un composto di colore blu scuro (indofenolo). Il test dell’ossidasi è una reazione comunemente usata per l’identificazione presuntiva delle colture di batteri Gram-negativi; differenzia infatti il genere Pseudomonas (ossidasi positivi) da altri microrganismi enterici (ossidasi negativi). Per l’esercitazione vengono utilizzate colture liquide di diversi batteri quali Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Shigella flexneri e Pseudomonas aeruginosa. A causa della potenziale patogenicità di alcuni batteri utilizzati, come già discusso, l’apertura delle colture e la reazione colorimetrica vanno eseguite sotto una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale.

 

Protocollo sperimentale

ü    Prendere con una pinzetta 5 dischetti test, intrisi di substrato cromogenico, e disporli su un supporto (es. piastra Petri) [Fig. 1].

ü    Ricoprire i dischetti con circa 100µl di coltura batterica liquida,

ü    Utilizzando i seguenti microrganismi: 1) Escherichia coli; 2) Bacillus subtilis; 3) Staphylococcus aureus; 4) Shigella flexneri; 5) Pseudomonas aeruginosa.

ü    Osservare per alcuni minuti (fino a 10-15) la reazione colorimetrica che si sviluppa.

ü    Nei batteri produttori di ossidasi si sviluppa una colorazione blu porpora in seguito alla reazione dell’enzima con il substrato cromogenico [Fig. 2].

 

Fig. 1: dischetti intrisi di substrato cromogenico (N,N-dimetil-p-fenilendiamina ossalato) per il test dell’ossidasi.

Fig. 2: reazione positiva di B. subtilis (2) e P. aeruginosa (5) e reazione negativa di E. coli (1), S. aureus (3) e S. flexneri (4) al test dell’ossidasi.