Laboratorio di
Microbiologia Generale
a cura di Gabriele Giliberti
Test dell’ossidasi
L’enzima citocromo
ossidasi svolge un importante ruolo durante il trasporto di elettroni della
catena respiratoria. Soltanto alcuni batteri possiedono tale enzima
respiratorio e la sua presenza può essere un carattere identificativo e può
essere messa in evidenza mediante un semplice test in cui un substrato
artificiale, l’N,N-dimetil-p-fenilendiamina ossalato, cede elettroni alla
citocromo ossidasi e ossidandosi forma un composto di colore blu scuro (indofenolo). Il test dell’ossidasi è
una reazione comunemente usata per l’identificazione presuntiva delle colture
di batteri Gram-negativi; differenzia infatti il genere Pseudomonas (ossidasi positivi) da altri microrganismi enterici
(ossidasi negativi). Per l’esercitazione vengono utilizzate colture liquide di diversi
batteri quali Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Shigella
flexneri e Pseudomonas aeruginosa.
A causa della potenziale patogenicità di alcuni batteri utilizzati, come già
discusso, l’apertura delle colture e la reazione colorimetrica vanno eseguite
sotto una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale.
Protocollo sperimentale
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Prendere con una pinzetta 5
dischetti test, intrisi di substrato cromogenico, e disporli su un supporto
(es. piastra Petri) [Fig. 1].
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Ricoprire i dischetti con circa
100µl di coltura batterica liquida,
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Utilizzando i seguenti microrganismi:
1) Escherichia coli; 2) Bacillus subtilis; 3) Staphylococcus aureus; 4) Shigella flexneri; 5) Pseudomonas aeruginosa.
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Osservare per alcuni minuti (fino a
10-15) la reazione colorimetrica che si sviluppa.
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Nei batteri produttori di ossidasi
si sviluppa una colorazione blu porpora in seguito alla reazione dell’enzima
con il substrato cromogenico [Fig. 2].
Fig. 1: dischetti
intrisi di substrato cromogenico (N,N-dimetil-p-fenilendiamina ossalato) per il
test dell’ossidasi.
Fig. 2:
reazione positiva di B. subtilis (2) e P. aeruginosa (5) e reazione negativa di
E. coli (1), S. aureus (3) e S. flexneri (4) al test dell’ossidasi.