Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Colorazione di Gram

Nel 1883 il fisico danese Gram scoprì che i batteri sono distinguibili in due grandi categorie. Effettuando infatti una colorazione con cristal violetto, seguita da un trattamento con una soluzione iodo-iodurata e con un agente decolorante, vide che un gruppo di cellule resisteva alla rimozione del cristal violetto, mentre un altro gruppo si decolorava rapidamente. Le cellule che conservano il cristal violetto risultavano blu e sono dette Gram-positive; quelle che perdono la colorazione blu sono dette Gram-negative e risultano rosa se esposte all’azione di un colorante di contrasto quale la safranina. Oggi sappiamo che i due tipi cellulari si colorano differentemente per la presenza di una diversa organizzazione della parete: i batteri Gram-negativi infatti presentano uno strato più sottile di peptidoglicano che viene colorato con intensità minore e che può essere più facilmente attraversato dal decolorante. Quando vengono utilizzati due o più coloranti ed altri reagenti come mordenzanti, come nel caso della colorazione di Gram, si parla di colorazione differenziale, in grado cioè di distinguere tra differenti tipologie di microrganismi o differenti strutture di un microrganismo. La colorazione di Gram rappresenta la colorazione differenziale maggiormente utilizzata e importante in batteriologia. I batteri (ad esempio bacilli come Escherichia coli o Bacillus subtilis) prelevati da una coltura in fase esponenziale vengono fissati al vetrino e colorati con cristal violetto; il vetrino viene poi trattato con una soluzione di iodio che agisce da mordenzante, facilita cioè la colorazione attraverso la formazione di un complesso che precipita all’interno della cellula. Il successivo lavaggio con una miscela di etanolo e acetone lava via il colorante dai batteri Gram-negativi che diventano incolori; l’utilizzo poi di un colorante di contrasto (safranina) permette una nuova colorazione dei Gram-negativi.

Protocollo sperimentale

ü Prelevare 5µl da una coltura liquida di batteri Gram-positivi (Bacillus subtilis) e da una coltura di batteri Gram-negativi (Escherichia coli) e deporli al centro di un vetrino portaoggetti.

ü Distribuire la sospensione batterica sul vetrino in modo da formare un sottile film.

ü Fissare il preparato passando il vetrino due o tre volte su una fiamma.

ü Mettere il vetrino in una vaschetta per la colorazione.

ü Coprire l’area del vetrino dove sono presenti le cellule fissate con una goccia di cristal violetto (colorante primario) e far agire per circa 1 minuto.

ü Lavare con acqua distillata per rimuovere il colorante in eccesso, aiutandosi eventualmente con carta assorbente per asciugare i bordi del vetrino.

ü Coprire l’area del vetrino dove sono presenti le cellule con la soluzione di iodio e far agire per circa 1 minuto.

ü Lavare con acqua distillata per pochi secondi.

ü Decolorare con alcool etilico/acetone 1:1 versandolo con una pipetta Pasteur fino a quando non sparisce il colore porpora.

ü Lavare con acqua distillata per pochi secondi.

ü Coprire l’area del vetrino dove sono presenti le cellule fissate con una goccia di safranina (colorante secondario) e far agire per circa 1 minuto.

ü Lavare con acqua distillata per rimuovere il colorante in eccesso, aiutandosi eventualmente con carta assorbente per asciugare i bordi del vetrino.

ü Far asciugare il preparato all’aria o passando il vetrino su una fiamma.

ü Osservare il vetrino al microscopio, aumentando progressivamente l’ingrandimento fino ad utilizzare l’obiettivo ad immersione (100x) [Fig. 2 e 3].

Fig. 1: schema riassuntivo della colorazione di Gram.

Fig. 2: osservazione al microscopio (ingrandimento 1000x) di cellule di cellule di B. subtilis (Gram+) e E. coli (Gram-).

Fig. 3: osservazione al microscopio (ingrandimento 1000x) di cellule di cellule di B. subtilis (Gram+) e E. coli (Gram-).