Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Titolazione per conta totale

In molte applicazioni sperimentali è necessario conoscere la concentrazione di una sospensione batterica. Il conteggio delle cellule presenti in una coltura in crescita (ad esempio di Escherichia coli) può essere effettuato in due diverse modalità (conta totale o conta vitale). La conta totale consiste nell’osservare al microscopio un campione a volume noto della coltura e contare le cellule presenti; tale metodo di conta si avvale di vetrini speciali, detti camere di conta, caratterizzati da reticoli con quadrati di dimensioni note che permettono di contare il numero di cellule presenti in un dato volume e quindi ottenere mediante opportuni fattori di conversione il titolo totale della coltura. Tale metodo non distingue tra cellule vive e morte all’interno della coltura. Il titolo della sospensione, ottenuto con opportuni fattori di conversione, si esprime in CFU / ml (unità formanti colonie).

Protocollo sperimentale

ü Operando sotto una cappa sterile, preparare 10 tubi sterili con 9 ml di soluzione fisiologica, siglandoli con l’indicazione della diluizione della coltura che sarà effettuata (da 10^-1 a 10^-10).

ü Prelevare 1 ml di sospensione batterica da una coltura di Escherichia coli e addizionarlo alla soluzione fisiologica contenuta nel tubo siglato 10^-1.

ü Agitare pochi secondi sul vortex per rendere omogenea la sospensione batterica.

ü Prelevare 1 ml di sospensione batterica dalla diluizione 10^-1 e addizionarlo alla soluzione fisiologica contenuta nel tubo siglato 10^-2, agitando sul vortex.

ü Ripetere le stesse operazioni fino alla diluizione 10^-10 [Fig. 1].

ü Prelevare una goccia di sospensione batterica da una diluizione e versarla al centro della camera di conta [Fig. 2].

ü Coprire con il vetrino coprioggetto, premendolo contro i bordi rialzati per far uscire il liquido in eccesso.

ü Contare al microscopio ottico (con un obiettivo da 40x) il numero di cellule presenti in alcuni dei quadrati grandi del reticolo (delimitati da tre linee parallele) [Fig. 3 e 4].

ü Calcolare il titolo della coltura (cellule/ml) utilizzando il numero medio di cellule contate (N) per quadrato: titolo = N x F.D. (fattore diluizione) x 10000.

Fig. 1: diluizioni seriali di una coltura batterica.

Fig. 2: camera di conta per la conta totale al microscopio.

Fig. 3: schema del reticolato della camera di conta.

Fig. 4: reticolo della camera di conta osservata al microscopio (ingrandimento 400x).