Laboratorio di
Microbiologia Generale
a cura di Gabriele Giliberti
Titolazione per conta vitale
In molte applicazioni sperimentali è necessario conoscere la
concentrazione di una sospensione batterica. Il conteggio delle cellule
presenti in una coltura in crescita (ad esempio di Escherichia coli) può essere effettuato in due diverse modalità
(conta totale o conta vitale). La conta
vitale permette di distinguere tra cellule vive e morte all’interno della
coltura: consiste nel diluire una coltura batterica e piastrare su terreno
solido le diverse diluizioni fino ad ottenere un numero contabile di colonie,
dopo opportuna incubazione alla temperatura ottimale di crescita del
microrganismo. Il titolo della
sospensione, ottenuto con opportuni fattori di conversione, si esprime in CFU /
ml (unità formanti colonie).
Protocollo sperimentale
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Operando sotto una cappa sterile,
preparare 10 tubi sterili con 9 ml di soluzione fisiologica, siglandoli con l’indicazione
della diluizione della coltura che sarà effettuata (da 10-1 a 10-10).
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Prelevare 1 ml di sospensione
batterica da una coltura di Escherichia
coli e addizionarlo alla soluzione fisiologica contenuta nel tubo siglato
10-1.
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Agitare pochi secondi sul vortex per
rendere omogenea la sospensione batterica.
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Prelevare 1 ml di sospensione
batterica dalla diluizione 10-1 e addizionarlo alla soluzione
fisiologica contenuta nel tubo siglato 10-2, agitando sul vortex.
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Ripetere le stesse operazioni fino
alla diluizione 10-10 [Fig. 1].
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Prelevare 0,1 ml da ciascuna
diluizione e versarli al centro di altrettante piastre di terreno solido LB
agar.
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Distribuire con una spatola monouso
la sospensione batterica su tutta la superficie della piastra.
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Capovolgere le piastre ed incubarle
a 37°C per 12-15 ore.
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Individuare la piastra di terreno
ottimale per la conta e contare il numero di colonie cresciute [Fig. 2 e 3].
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Calcolare il titolo iniziale della
coltura batterica di partenza (CFU/ml) applicando la formula: (numero di
colonie / 0,1 ml) x fattore diluizione.
Fig. 1: schema
di diluizioni seriali di una coltura batterica.
Fig. 2: diluizioni
da 10-1 a 10-4 seminate su terreno solido.
Fig. 3: diluizioni
da 10-5 a 10-8 seminate su terreno solido.
