Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Titolazione per conta vitale

 

In molte applicazioni sperimentali necessario conoscere la concentrazione di una sospensione batterica. Il conteggio delle cellule presenti in una coltura in crescita (ad esempio di Escherichia coli) pu essere effettuato in due diverse modalit (conta totale o conta vitale). La conta vitale permette di distinguere tra cellule vive e morte allinterno della coltura: consiste nel diluire una coltura batterica e piastrare su terreno solido le diverse diluizioni fino ad ottenere un numero contabile di colonie, dopo opportuna incubazione alla temperatura ottimale di crescita del microrganismo. Il titolo della sospensione, ottenuto con opportuni fattori di conversione, si esprime in CFU / ml (unit formanti colonie).

 

Protocollo sperimentale

    Operando sotto una cappa sterile, preparare 10 tubi sterili con 9 ml di soluzione fisiologica, siglandoli con lindicazione della diluizione della coltura che sar effettuata (da 10-1 a 10-10).

    Prelevare 1 ml di sospensione batterica da una coltura di Escherichia coli e addizionarlo alla soluzione fisiologica contenuta nel tubo siglato 10-1.

    Agitare pochi secondi sul vortex per rendere omogenea la sospensione batterica.

    Prelevare 1 ml di sospensione batterica dalla diluizione 10-1 e addizionarlo alla soluzione fisiologica contenuta nel tubo siglato 10-2, agitando sul vortex.

    Ripetere le stesse operazioni fino alla diluizione 10-10 [Fig. 1].

    Prelevare 0,1 ml da ciascuna diluizione e versarli al centro di altrettante piastre di terreno solido LB agar.

    Distribuire con una spatola monouso la sospensione batterica su tutta la superficie della piastra.

    Capovolgere le piastre ed incubarle a 37C per 12-15 ore.

    Individuare la piastra di terreno ottimale per la conta e contare il numero di colonie cresciute [Fig. 2 e 3].

    Calcolare il titolo iniziale della coltura batterica di partenza (CFU/ml) applicando la formula: (numero di colonie / 0,1 ml) x fattore diluizione.

 

Fig. 1: schema di diluizioni seriali di una coltura batterica.

Fig. 2: diluizioni da 10-1 a 10-4 seminate su terreno solido.

Fig. 3: diluizioni da 10-5 a 10-8 seminate su terreno solido.