Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Test di fermentazione

Le fermentazioni sono reazioni biochimiche deputate alla produzione di energia, in cui molecole organiche fungono sia da accettori che da donatori di elettroni. La capacità dei microrganismi di fermentare carboidrati e la tipologia dei prodotti finali formati (alcool, acidi, gas o altre molecole organiche) possono essere usati come elementi identificativi. Gli acidi prodotti durante la fermentazione (es. acido acetico, acido butirrico) abbassano il pH del mezzo e la presenza di un indicatore di pH, cioè una molecola come il rosso fenolo che vira di colore verso il giallo con l’abbassarsi del pH, può essere utilizzato per evidenziare tale produzione. Utilizzando terreni contenenti un indicatore di pH e diversi carboidrati si può verificare quali carboidrati vengono utilizzati nella fermentazione. La produzione di gas (CO₂) può essere invece evidenziata con un piccolo tubo invertito (tubo di Durham) che si inserisce nel tubo di crescita contenente il terreno di coltura prima della sterilizzazione in autoclave; durante la fermentazione, la produzione di gas all’interno del tubo di Durham forma una bolla che rimane intrappolata nel terreno ed è facilmente osservabile. Utilizzando un terreno di coltura contenente un carboidrato, peptone e un indicatore di pH ed effettuando la crescita microbica in provette contenenti tubi Durham possiamo quindi osservare diversi tipi di risposta: 1) viraggio a giallo del terreno e formazione di una bolla nel tubo Durham: i microrganismi utilizzano il carboidrato per fermentare producendo acidi organici e gas (es. Escherichia coli); 2) viraggio a giallo del terreno: i microrganismi utilizzano il carboidrato per fermentare producendo acidi organici (es. Shigella flexneri); 3) nessuna reazione e aumento di torbidità nella provetta: i microrganismi crescono utilizzando peptone come fonte alternativa di energia (es. Pseudomonas aeruginosa). Per l’esercitazione vengono utilizzate colture liquide di diversi batteri. A causa della potenziale patogenicità di alcuni batteri utilizzati, come già discusso, l’apertura delle colture e gli inoculi vanno eseguiti sotto una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale.

Protocollo sperimentale

ü Versare in un beker 100 ml di acqua distillata, aggiungere un magnete e mettere in agitazione su una piastra riscaldante.

ü Versare nel beker l’opportuna quantità di polvere di terreno di coltura Phenol Red Dextrose broth e agitare finché la soluzione non risulti omogenea.

ü Trasferire 10 ml di soluzione in ognuna delle provette di vetro e aggiungere un tubo di Durham in ciascuna provetta.

ü Sterilizzare in autoclave per 15 minuti e far raffreddare il terreno (fino a circa 45 °C).

ü Prelevare 100µl di alcune delle seguenti colture batteriche liquide e inocularli nelle provette [Fig. 1].

ü Utilizzare vari microrganismi, tra cui: Escherichia coli; Shigella flexneri e Pseudomonas aeruginosa.

ü In una provetta non effettuare nessun inoculo (controllo negativo).

ü Incubare le provette a 37°C in agitazione.

ü Osservare e annotare i fenomeni correlati alla produzione di acido e gas nelle diverse coltura, dopo 3 ore e dopo 12-15 ore di incubazione [Fig. 2 e 3].

ü Provette di E.coli e K. Pneumoniae: reazione colorimetrica positiva e formazione di una bolla nel tubo di Durham (produzione di acidi e gas durante la fermentazione).

ü Provette di S. flexneri ed altri batteri: reazione colorimetrica positiva (produzione di acidi durante la fermentazione).

ü Provette di P. aeruginosa: reazione colorimetrica negativa e torbidità nella coltura (crescita del microrganismo con metabolismo non fermentativo).

Fig. 1: preparazione delle provette (con tubo di Durham) per il test di fermentazione.

Fig. 2: provette con i diversi microrganismi dopo l’incubazione a 37°C.

Fig. 3: esempi delle diverse reazioni possibili: produzione di acidi e gas; produzione solo di acidi; crescita senza fermentazione; controllo negativo.