Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Curva di crescita batterica

La crescita di una coltura batterica a termine, effettuata cioè in un volume definito di terreno come quelle normalmente effettuate in laboratorio, è caratterizzata dalla successione di quattro fasi. Prima che i batteri inizino a duplicarsi, quando vengono trasferiti in condizioni di crescita diverse da quelle di partenza, è necessario che sintetizzino tutti gli enzimi e coenzimi necessari per la crescita; questa fase di adattamento in cui non si duplicazione cellulare è definita latenza. Poi i batteri iniziano a duplicarsi velocemente in maniera esponenziale, sfruttando al massimo le risorse disponibili (fase esponenziale). Il progressivo esaurimento delle risorse disponibili e l’accumulo di prodotti di rifiuto determinano poi la fine della fase esponenziale e l’ingresso nella fase stazionaria di crescita, in cui si ha un equilibrio tra cellule in divisione e cellule che iniziano a morire, per cui il numero di cellule in coltura rimane costante. La coltura entra infine in una fase di morte massiva, che può essere caratterizzata o meno da lisi cellulare. Un metodo veloce e non distruttivo per seguire una curva di crescita batterica, al fine ad esempio di determinarne il tempo di generazione, è la turbidometria. Un terreno contenente un inoculo batterico infatti con il procedere della crescita diventa progressivamente più torbido e tale aumento di torbidità è proporzionale al numero di cellule presenti (per gli organismi unicellulari). La misura della torbidità è una misura indiretta della biomassa, ma durante la fase logaritmica di crescita può essere correlata al numero di cellule in coltura. Viene effettuata da uno strumento, lo spettrofotometro, in grado di rilevare la percentuale di luce trasmessa da una coltura batterica (trasmittanza) se attraversata da un fascio di luce incidente; il valore viene espresso in termini di assorbanza (inverso della trasmittanza) ed è proporzionale all’aumento di cellule nella coltura. Riportando i dati di assorbanza in funzione logaritmica del tempo si può costruire una curva di crescita che permette di individuare le diverse fasi di crescita e di determinare il tempo di generazione del microrganismo in questione. Ogni specie batterica ha un intervallo di temperature all’interno del quale è in grado di crescere e riprodursi che è determinato dalla diversa sensibilità di enzimi ed altri componenti cellulari al caldo e al freddo; all’interno di tale intervallo vi è poi una temperatura ottimale di crescita alla quale i microrganismi si riproducono con il tempo di generazione minore. Anche il pH è un fattore che influenza fortemente la crescita batterica, alterando la funzionalità degli enzimi coinvolti nel metabolismo. I parametri che influenzano la crescita e il cui effetto viene misurato in questa esperienza sono la temperatura, il pH e l’agitazione che permette l’ottimale distribuzione di ossigeno e nutrienti nella coltura di Escherichia coli, utilizzato per il suo tempo di generazione corto.

Protocollo sperimentale

ü Preparare 4 beute sterili da 250 ml con 25 ml di terreno di coltura LB liquido in ciascuna beuta.

ü Siglare le beute con le condizioni di crescita da utilizzare: 1) 37°C - pH 7.0 - agitazione; 2) 25°C - pH 7.0 - agitazione; 3) 37°C - pH 7.0 - senza agitazione; 4) 37°C - pH 5.0 - in agitazione.

ü Preriscaldare le beute con i terreni alle rispettive temperature di utilizzo.

ü Prelevare 1 ml da una coltura liquida di Escherichia coli e addizionarla a 9 ml di terreno LB (diluizione 1:10).

ü Agitare e aliquotare 1 ml della diluizione in una cuvetta [Fig. 1].

ü Preparare una seconda cuvetta contenente 1 ml di LB da utilizzare per l’azzeramento dello spettrofotometro.

ü Leggere allo spettrofotometro la densità ottica a 600nm (DO₆₀₀).

ü Moltiplicare il valore letto dallo strumento per 10, in modo da ottenere la DO₆₀₀ della coltura di partenza.

ü Effettuare un inoculo della coltura batterica iniziale nei diversi terreni di coltura preparati, diluendo la coltura di partenza fino ad una DO₆₀₀ di 0.1.

ü Calcolare il volume di coltura iniziale da inoculare in ciascuna beuta, utilizzando la formula: 0.1 × 25 ml / DO₆₀₀ (coltura iniziale).

ü Prelevare con una pipetta la quantità di coltura iniziale da inoculare (determinata al punto precedente) e aggiungerla alle diverse beute.

ü Prelevare 1 ml da ciascuna coltura e trasferirlo in una cuvetta per leggere la DO₆₀₀ iniziale (punto t0).

ü Incubare le beute alle diverse condizioni: 1) a 37°C in agitazione; 2) a 25°C in agitazione; 3) a 37°C senza agitazione; 4) a 37°C in agitazione [Fig. 2].

ü Dopo 60 minuti prelevare 1 ml di ciascuna coltura e trasferirlo in una cuvetta per leggere la DO₆₀₀ (punto t1).

ü Ogni 30 minuti prelevare 1 ml di ciascuna coltura e trasferirlo in una cuvetta per leggere la DO₆₀₀ (punti t2-3-4-5-6).

ü Annotare tutte le letture in una tabella [Fig. 3].

ü Costruire le diverse curve di crescita, riportando in grafico la DO₆₀₀ in funzione del tempo [Fig. 4].

Fig. 1: trasferimento di un’aliquota di coltura batterica dalla beuta alla cuvetta per la lettura allo spettrofotometro.

Fig. 2: termostato a 37°C con agitazione per la crescita di E. coli.

Fig. 3: dati di densità ottica a 600nm raccolti durante la crescita di E. coli in diverse condizioni di crescita.

Fig. 4: curve di crescita ottenute con i dati delle DO₆₀₀ in funzione dei minuti.