Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Colorazione semplice

La densità dei batteri è solo leggermente più alta di quella dell’acqua, per cui si osservano difficilmente al microscopio, risultando quasi trasparenti. Per vedere meglio i batteri si usano i coloranti che consentono di aumentare il contrasto tra l’organismo e lo sfondo, in modo da osservare e differenziare meglio le diverse morfologie cellulari. I coloranti sono generalmente sali nei quali uno dei due ioni è colorato. Ad esempio il blu di metilene è il sale cloruro di metilene che in acqua si dissocia nello ione blu metilene carico positivamente e lo ione cloruro incolore carico negativamente. I coloranti possono essere divisi in due gruppi: se la parte colorata del colorante è uno ione positivo, come nel caso sopra citato, il colorante viene detto basico (ad esempio blu di metilene, cristal violetto, safranina); se la parte colorata è lo ione carico negativamente viene detto acido (ad esempio nigrosina, rosso congo). A causa della loro natura chimica, i citoplasmi di tutte le cellule batteriche hanno una debole carica negativa se fatte crescere in un mezzo a pH neutro. Quando si usa quindi un colorante basico, che presenta affinità per le strutture acide, l’organismo si colorerà direttamente. Per preparare i batteri alla colorazione (ad esempio bacilli come Escherichia coli o Bacillus subtilis), si realizza sul vetrino un sottile film cellulare che viene fissato al vetrino per evitare che durante le procedure per la colorazione venga lavato via. Il fissaggio viene effettuato passando il vetrino su una fiamma: in questo modo i batteri, oltre ad essere “incollati” al vetrino, vengono uccisi e ciò permette un ingresso facilitato del colorante nella cellula. Una volta fissato il preparato, si aggiunge il colorante e si aspetta per circa un minuto, in modo che penetri nelle cellule; il colorante in eccesso viene poi lavato via con acqua. L’uso di un singolo colorante basico per aumentare il contrasto tra batteri e fondo viene definito colorazione semplice e fornisce informazioni su forma e dimensioni cellulari.

Protocollo sperimentale

ü Prelevare 10µl da una coltura liquida di Escherichia coli o Bacillus subtilis e deporli al centro di un vetrino portaoggetti.

ü Distribuire la sospensione batterica sul vetrino in modo da formare un sottile film.

ü Fissare il preparato passando il vetrino due o tre volte su una fiamma.

ü Mettere il vetrino in una vaschetta per la colorazione.

ü Coprire l’area del vetrino dove sono presenti le cellule fissate con una goccia di blu di metilene o di safranina e far agire per circa 1 minuto.

ü Lavare con acqua distillata per rimuovere il colorante in eccesso, aiutandosi eventualmente con carta assorbente per asciugare i bordi del vetrino.

ü Far asciugare il preparato all’aria o passando il vetrino su una fiamma.

ü Osservare il vetrino al microscopio, aumentando progressivamente l'ingrandimento fino ad utilizzare l’obiettivo ad immersione (100x).

Fig. 1: colorazione con blu di metilene della sospensione batterica su vetrino.

Fig. 2: lavaggio per rimuovere il colorante in eccesso.

Fig. 3: osservazione al microscopio (ingrandimento 1000x) di cellule di E. coli colorate con blu di metilene.

Fig. 4: osservazione al microscopio (ingrandimento 1000x) di cellule di B. subtilis colorate con safranina.