Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Osservazione al microscopio ottico

I microrganismi presentano due principali tipi di morfologia cellulare: microrganismi sferici, detti cocchi, e microrganismi cilindrici, detti bacilli. A seguito di una divisione cellulare incompleta, i cocchi possono rimanere disposti in coppia (diplococchi) o a formare catene (streptococchi) o grappoli (stafilococchi). I bacilli possono avere morfologie diverse: a bastoncino (bacilli propriamente detti), forme streptobacillari, forme con una o due curve (vibrioni o spirilli), elementi con molte curve (spirochete). Le cellule batteriche sono mediamente di dimensioni che vanno da 1 a 10 µm, per cui la loro osservazione è possibile solo attraverso l’utilizzo di un microscopio ottico, un sistema di due lenti convergenti, dette obiettivo e oculare, inserite all’estremità di un tubo metallico della lunghezza standard di 16 cm, appoggiato su un sostegno, detto stativo. L’oggetto da osservare viene posto davanti all’obiettivo su un apposito piatto, sotto il quale si trova un sistema di lenti, il condensatore, che fa convergere sull’oggetto la luce prodotta da una lampadina incorporata nel microscopio; il condensatore, attraverso un diaframma di apertura, permette di modificare l’ampiezza del cono di luce. La distanza tra obiettivo e preparato può essere variata con un movimento del tubo regolato da due viti, quella macrometrica per spostamenti rapidi e quella micrometrica per la messa a fuoco fine. Con movimenti laterali del piatto si può inoltre selezionare la parte del preparato da osservare. Le caratteristiche fondamentali di un microscopio ottico sono l’ingrandimento e il potere di risoluzione. L’ingrandimento è il rapporto fra le dimensioni dell’immagine osservata e quelle dell’oggetto e dipende dal prodotto degli ingrandimenti forniti dall’oculare (10×) e dall’obiettivo (10×, 40×, 100×). L’utilizzo dell’obiettivo 100× comporta l’utilizzo di olio di immersione da interporre tra la lente e il preparato, per ridurre l’effetto di rifrazione della luce nel passare dal vetro all’aria, permettendo così lo sfruttamento di un maggiore cono di luce. Il potere di risoluzione è la capacità di vedere come distinti due punti molto vicini. La distanza minima alla quale due punti sono visti come distinti si chiama limite di risoluzione. Il limite di risoluzione del microscopio ottico risulta pari a 0,2 micron, con un aumento del potere risolvente rispetto a quello dell’occhio umano (che si aggira sugli 0,2 mm) di circa 1000 volte. È interessante osservare al microscopio colture di cocchi e di bacilli per analizzare le due diverse morfologie cellulari; per confrontare la loro struttura cellulare procariotica con quella eucariotica è interessante osservare anche cellule di lievito prelevate da un comune panetto per uso alimentare.

Protocollo sperimentale

ü Deporre con un’ansa da 10µl una goccia di soluzione fisiologica al centro di un vetrino portaoggetti.

ü Partendo da una coltura di batteri in terreno solido, prelevare con un’ansa da 1µl una colonia isolata in piastra e stemperarla al centro del vetrino, nella soluzione fisiologica.

ü Partendo da una coltura di batteri in terreno liquido, prelevare con un’ansa da 10µl una goccia di coltura e porla al centro del vetrino [Fig. 1].

ü Coprire il preparato con un vetrino coprioggetti.

ü Assorbire l’eccesso di liquido all’esterno del vetrino coprioggetti con un pezzetto di carta assorbente.

ü Osservare il vetrino al microscopio, aumentando progressivamente l’ingrandimento fino ad utilizzare l’obiettivo ad immersione (100x) [Fig. 2].

ü Prelevare con un’ansa da 10µl un piccolo quantitativo di cellule da un panetto di lievito e scioglierlo in 4-5 ml di soluzione fisiologica.

ü Prelevare 10µl dalla soluzione e porli al centro di un vetrino portaoggetti.

ü Coprire il preparato con un vetrino coprioggetti.

ü Assorbire l’eccesso di liquido all’esterno del vetrino coprioggetti con un pezzetto di carta assorbente.

ü Osservare il vetrino al microscopio, aumentando progressivamente l’ingrandimento fino ad utilizzare l’obiettivo ad immersione (100x) [Fig. 3].

Fig. 1: colture liquida e solida di batteri per l’osservazione al microscopio.

Fig. 2: microscopio ottico e materiale occorrente per l’osservazione.

Fig. 3: cellule di lievito osservate al microscopio ottico (ingrandimento 400x).