Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Preparazione di un terreno di coltura

La crescita dei microrganismi dipende dalla disponibilità di nutrienti e dalla presenza di condizioni ambientali favorevoli. I microrganismi necessitano per la loro crescita e per la loro divisione dei quattro elementi principali che costituiscono la loro biomassa (carbonio, ossigeno, idrogeno e azoto), di altri macronutrienti con funzioni biologiche importanti (fosforo, zolfo, potassio, magnesio, ferro, calcio, sodio). Le soluzioni acquose contenenti i nutrienti necessari, utilizzate in laboratorio, vengono definite terreni di coltura e si dividono in terreni liquidi e terreni solidi, con questi ultimi caratterizzati dalla presenza di un agente solidificante (agar). I terreni liquidi vengono usati per crescere grandi quantità di microrganismi e la crescita si effettua in provette o in beute nel caso di microrganismi aerobi, in modo da mettere i microrganismi a contatto con la maggior quantità di ossigeno possibile. I terreni solidi permettono una crescita in superficie dei microrganismi e sono usati per osservare la morfologia di colonia, per isolare colture pure o per osservare specifiche reazioni biochimiche. L’agar è ricavato dalle alghe marine e viene usato grazie alle sue proprietà fisiche: si scioglie infatti a circa 100°C e rimane liquido se raffreddato fino a circa 40°C, quindi diventa gel. I mezzi di coltura contenenti agar sono distribuiti in recipienti piatti coperti, chiamati piastre di Petri, dove le cellule microbiche possono crescere e formare masse visibili (colonie). Oltre a fornire ai microrganismi da coltivare le condizioni ambientali e i nutrienti appropriati, è anche essenziale evitare che altri organismi (contaminanti) entrino nella coltura. La completa eliminazione di tutti i microrganismi presenti nel terreno di coltura può essere ottenuta mediante sterilizzazione per 15 minuti in autoclave, dove si realizzano le condizioni in cui microrganismi e spore non sopravvivono (1 atm di sovrapressione; temperatura di 121ºC). I terreni liquidi una volta sterilizzati in autoclave e fatti raffreddare fino a una temperatura di circa 25°C possono essere utilizzati; i terreni agarizzati invece vanno fatti raffreddare fino a circa 45°C e quindi versati nelle piastre Petri (circa 25ml per piastra), prima che l’agar solidifichi. Per mantenere le condizioni di sterilità ed evitare contaminazioni ambientali è importante versare il terreno nelle piastre Petri in una cappa sterile a flusso orizzontale oppure in una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale. Un esempio di terreno di coltura è il terreno LB (triptone 1%, estratto di lievito 0.5%, NaCl 1%), usato per il mantenimento e la propagazione di Escherichia coli, un enterobatterio ampiamente impiegato nelle procedure di microbiologia e genetica, grazie ad alcune caratteristiche che ne fanno un microrganismo “modello”, quali ad esempio un tempo di generazione corto, la mancanza di patogenicità (almeno per quanto riguarda i ceppi utilizzati in laboratorio) e la facilità di subire manipolazioni genetiche.

Protocollo sperimentale

ü Fare le opportune pesate per la preparazione di 1 litro di terreno LB: triptone 10 g, estratto di lievito 5 g, NaCl 10 g, agar 10 g [Fig. 1].

ü Versare in un beker 900 ml di acqua distillata.

ü Aggiungere un magnete e mettere in agitazione su una piastra riscaldante.

ü Versare delicatamente le polveri pesate nel beker, escluso l’agar, e agitare finché la soluzione non diventa omogenea.

ü Trasferire la soluzione in un cilindro graduato e portare a volume (1 litro) con acqua distillata.

ü Trasferire la soluzione in due bottiglie (500 ml ciascuna) e siglarle opportunamente.

ü Aggiungere la polvere di agar (al 2%) nella bottiglia predisposta per il terreno LB solido.

ü Sterilizzare in autoclave per 15 minuti [Fig. 2].

ü Dopo la sterilizzazione far raffreddare il terreno (fino a circa 45 °C).

ü Siglare 25 piastre Petri con il nome del terreno (LB) e prepararle sul piano di una cappa a flusso laminare, togliendo il coperchio.

ü Versare delicatamente il terreno LB agar nelle piastre (circa 20-25 ml per piastra) facendo attenzione a non provocare la formazione di bolle [Fig. 3].

ü Lasciare solidificare il terreno senza spostare le piastre [Fig. 4].

ü Utilizzare le piastre LB agar e il terreno LB liquido oppure conservarli a 4°C.

Fig. 1: pesata delle polveri per la preparazione del terreno di coltura.

Fig. 2: autoclavi per la sterilizzazione dei terreni di coltura.

Fig. 3: terreno agarizzato mentre viene versato nelle piastre Petri.

Fig. 4: piastre Petri con terreno solidificato.