Laboratorio di Microbiologia Generale

a cura di Gabriele Giliberti

Test del citrato

Il test del citrato identifica i microrganismi in grado di utilizzare il citrato come unica fonte di carbonio. Rientra in una serie di test biochimici, noti come IMViC tests (acronimo che indica: Indole, Methyl red, Voges-Proskauer, Citrate), impiegati per l’identificazione degli Enterobatteri. Gli Enterobatteri includono un numero ampio di batteri Gram-, tra cui i generi Klebsiella, Enterobacter ed Escherichia, il cui habitat naturale è costituito dall’intestino dell’uomo e di altri animali. La presenza di E. coli è ad esempio utilizzata come indicatore di contaminazione fecale di cibo e acqua. Il terreno impiegato per il test contiene citrato, ioni ammonio e altri ioni inorganici, oltre all’indicatore di pH, blu di bromotimolo. Durante la crescita gli organismi positivi al test (come ad esempio Klebsiella pneumoniae) utilizzano il citrato come fonte di carbonio, incorporandolo attraverso citrato-permeasi all’interno della cellula, e i sali di ammonio come fonte di azoto, producendo ammoniaca (NH₃) e idrossido di ammonio (NH₄OH) che fanno aumentare il pH del mezzo causando il viraggio a blu dell’indicatore (che è invece verde a pH 7.0). Se quindi dopo incubazione il terreno rimane verde il test è negativo, se diventa blu è positivo; alcuni microrganismi citrato-negativi riescono in parte a crescere nel terreno ma non causano viraggio del colore. A causa della sua potenziale patogenicità come già discusso, l’apertura della coltura liquida di K. Pneumoniae e l’isolamento su piastra vanno eseguiti sotto una cappa di sicurezza biologica a flusso verticale.

Protocollo sperimentale

ü Sciogliere in una bottiglia con 50 ml di acqua distillata l’opportuna quantità di polvere di terreno Simmons Citrate agar.

ü Sterilizzare in autoclave, versare il terreno di coltura in due piastre Petri e lasciarlo solidificare nelle piastre [Fig. 1].

ü Prelevare 20µl di coltura batterica liquida ed effettuare un isolamento su ciascuna piastra

ü Utilizzare i seguenti microrganismi: 1) Klebsiella pneumoniae; 2) Escherichia coli.

ü Incubare le piastre a 37°C per 12-15 ore.

ü Osservare le piastre di K. pneumoniae dopo l’incubazione (reazione positiva): K. pneumoniae utilizza il citrato determinando alcalinizzazione del terreno e colorazione blu [Fig. 2].

ü Osservare le piastre di E. coli dopo l’incubazione (reazione negativa): E. coli non utilizza il citrato e non riesce a crescere, lasciando invariato il colore del terreno [Fig. 2].

Fig. 1: preparazione di piastre Simmons Citrate agar.

Fig. 2: test del citrato, piastre di E. coli (a sinistra) e K. pneumoniae (a destra) dopo incubazione a 37°C.